Histological Techniques and Tissue Preparation Guide

DOKU TESPT VE TESPTE ETK EDEN FAKT RLER 1 5.Hafta

TESPT=FKSASYON 2

DOKULARIN HAZIRLANMASI Dokular n y ntem, mikroskobuyla incelemektir. incelenmesinde histolojik kullan lan haz rlayarak en yayg n k kesitler Genellikle dokular, i inden nge i ine olanak tan mayacak kadar kal nd r. Mikrotom ad verilen aletlerle, dokular ince kesitler halinde dilimlenir ve bir dizi i lemden ge irilerek haz rlan r. 3

HSTOLOJK TEKNKLER Tespit ve y kama Doku takibi Dehidrasyon (suyunu giderme) effafla t rma Sertle tirme Bloklama/g mme Kesit alma ve lama yap t rma Boyama Kapatma 4

DOKU TESPT (FKSASYON) Fiksasyonun amac h crelerin ve doku elemanlar n ncanl hale yak n bir konumda muhafaza etmektir. Tespitin amac ; H crelerin bi imini bozmadan, i eriklerini eritmeden muhafaza etmek Kolayl kla dif zyona u rayan maddelerin kayb n nlemek Doku takibinde b z lmelerini nlemek Dokuyu boyamay kolayla t ran bir duruma getirmek 5

DOKU TESPT Is Fiziksel Dondurma Tespit y ntemleri Kimyasal Kurutma 6

FZKSEL YNTEMLER Is B y k par alar n tespitinde kullan l r. Proteinler denat re olur, ya lar erir. Dondurma H zl tan da kullan l r. z n r maddelerin kayb n , h cresel yap lar n yer de i tirmesini, kimyasal de i iklikleri, protein y k m n en aza indirir. Kurutma Kan ve kemik ili i yaymalar nda kullan l r. 7

KMYASAL YNTEMLER En fazla kullan lan y ntemdir. Doku tespitinde kullan lans v haldeki kimyasal madde ya da kar mlara fiksatif ad verilir. Tespit teknikleri: mmersiyon(dald rma) Perf zyon (bas n uygulama) 8

MMERSYON Geni a zl ve a z iyi kapanan kaplar i erisinde tespitin yap lmas d r. Tespit edilecek organ/doku rneklerinin b t n y zeylerinin sol syonla do rudantemas n nolmas gerekir. Beyin gibi yumu akdokular n tespitinde, organ n kaba as larak zemine dokunmamas ve her y z n n tespit sol syonuna temas n nsa lanmas gerekir. Tespit s resince kaplar n ara ara alkalanmas ve kar t r lmas gerekir. 9

PERFZYON Deneysel al malarda, anestezi alt ndakihayvan nkan n n bo alt larak hangi organdan rnek al nacak ise o organ n atardamar sisteminden, v cut s s nda,d kbas n alt nda izotonik sol syon verilip damar sisteminin y kanmas d r. Daha sonra tespit sol syonu ayn yolla verilerek organ kar l r ve tespit sol syonuna al n r. 10

Y FKSATFN ZELLKLER H cre i ine abuk dif ze olmal d r. H cre i eri ini erimeyen maddeler bi iminde ve ok iyi kt rmelidir. Dokuyu sonraki i lemler s ras nda b z lmeden korumal d r. Baz h cre k s mlar n n boyalarla zel olarak boyanabilmesini sa lamal d r. 11

TESPTE ETK EDEN FAKTRLER Tespit sol syonunun amaca g re se imi Tespit sol syonunun miktar Tespit sol syonunun pH Tespit sol syonunun osmolalitesi Tespit s resi 12

TESPT SOLSYONUNUN AMACA GRE SEM rne in; suda haz rlanm bir fiksatif dokudaki glikojeni, alkolde haz rlanm bir fiksatif ise lipitleri eritece inden s z konusu maddelerin ara t r lmas ndakullan lmaz. N kleus ya da kromozomlar incelenecekse asit fiksatifler ok s k kullan l r. Aseton, formalin ve glutaraldehit en az denat rasyona neden olduklar ndan ve enzimleri de iyi koruduklar ndan enzim etkinli iniara t rmalar ndakullan l r. 13

TESPT SOLSYONUNUN MKTARI Tespit sol syonu ile bu sol syon i erisine konulacak doku rne ininoran nemlidir. Tespit sol syonuna fazla rnek konursa sol syon i indeki kimyasallar yetersiz kal r ve uygun bir tespit olu maz. Genellikle 1:20 - 1:50 oran ile iyi sonu lar al n r. 14

TESPT SOLSYONUNUNPHI Genellikle h cre ekirdek ve sitoplazmas birbirine z t pH de erlerinde iyi sonu verir. pH asit oldu unda; ekirdek sitoplazmaya g re daha iyi korunur. pH alkali oldu unda; sitoplazma ekirde e g re daha iyi korunur. 15

TESPT SOLSYONUNUN OSMOLALTES Hipertonik sol syonlar n h cre b z mesine, hipotonik sol syonlar n h cre i mesine neden oldu ug sterilmi tir. En iyi sonu lar n ise hafifce hipertonik sol syonlarla (400-450 mosm) elde edildi ibulunmu tur. 16

TESPT SRES e itli fakt rlere ba l d r: rne inb y kl Tespit sol syonunun dif zyon g c : Sol syonun cinsine ve tespit edilen organ/doku rne ininyap sal ve fonksiyonel zelli ineba l d r. Ortam s s : Ortam s s azalaca ndan tespit de gecikir. Ama Doku rne ininyap s : Embriyonal dokular ve yumu ak dokular daha k sa s rede tespit edilirken, sert dokular ya da organ kaps lleri daha uzun s rede tespit edilir. d k oldu unda, dif zyon h z 17

PATOLOJ LABORATUVARINA GELEN MATERYALLERN KONTROLVE KAB L Fiksasyon i inde gelen par alar n fiksasyon miktarlar kontrol edilir. Materyallerin konuldu ukaplar n, tespit sol syonunun buharla mas n ve d k lmesini nleyecek ekildekapakl olmas gerekir. Materyal kaplar n na zgeni li ipar ay kolayl kla kar labilecek b y kl kte olmal d r. Dokunun, materyal kab ndas k mam ve y zer durumda olmas gerekir. Eksik fiksatatif bulunan kaplara yeterince fiksatatif ilave edilir. Fiksatif miktar , par a b y kl n n 20 ile 50 kat kadar olmal d r. Par an n t m fiksatif i inde kalmal d r. 18

PATOLOJ LABORATUVARINA GELEN MATERYALLERN KONTROLVE KAB L Fiksatif i indeki materyaller oda s cakl nda bekletilir. Tespit s ras nda fiksatif zaman zaman alkalanarak dokunun hareket etmesi sa lan r. Tespit s resince kaplar karanl kta bekletilir. Fiksatif y zeyine km b y k organ dokular n n zeri gazl bezle rt lerek fiksatifle temas etmesi sa lan r. 19

PATOLOJ LABORATUVARINA GELEN MATERYALLERN KONTROLVE KABUL zellikle ya l dokular, tespit sol syonu zerinde y zer durumda ise zeri gazl bezle rt l r. B y k materyaller genellikle 24 saat fiksasyon eriyi i i erisinde bekletilir. Endoskopik, i ne biyopsisi, spunch vb. k k par alar fiksasyonda 3-4 saat bekletilerek al mayaal n r. n tan lara g re baz rneklerin fiksasyon s resi uzat l r (kist hidatik, t berk loz ). 20

DOKU TESPT Tespit i lemi; Dokuyu h cresel enzimlerin neden oldu u otoliz ve bakteri ya da mantarlarca olu turulan dekompozisyondan korur, nfeksiy zajanlar inaktive eder ya da ld r r, Dokuyu sertle tirir ve doku komponentlerini stabilize eder. yi bir fiksatif, ld r c , n fuz edici ve sertle tirici nitelikte olmal d r. 21

FKSATFLERNLEVLER Doku/organ ,i lemlers ras ndade i ikli eu ramayacak mikroanatomik yap i erisinde tutmak, Otoliz ve p trefaksiyon ( r me) gibi de i iklikleri nlemek, H credeki yap ta lar n z nmez hale getirmek. 22

FKSATFLERN ZELLKLER Dokuyu b zmemeli, i irmemeli ve eritmemeli, Enzimleri inaktive etmeli, Dokudaki mikroorganizmalar ld rmeli, Dehidratan, kar la t nda dokunun orijinal eklinikorumas n sa layacak ekilde doku elemanlar n de i ikli eu ratmal . effafland r c , sertle tirici ve boyay c ajanlarla 23

FKSATF TRLER Aldehitler: Formaldehit, gluteraldehit Oksitleyici ajanlar: Osmiyum tetroksit, potasyum permanganat, potasyum dikromat Protein denat rasyonu yapanlar: Metil alkol, etil alkol, asetik asit Di er: Civa klor r, pikrik asit, Carnoy fiksatifi, Bouin sol syonu.. 24

FORMALN Bir ok patoloji laboratuvar ndakullan lan standart fiksatif %10 luk formalindir. Formalin, formaldehitin sudaki %40 l k zeltisidir. Her t rl materyalin rutin fiksasyonu i in kullan labilir. Ucuzdur ve doku bozulmadan uzun s re saklanabilir. 25

FORMALN Formalinle imm nohistokimya uygulanabilir. tespit edilen dokulara bir ok zel boya ve Tespit, proteinlerin apraz ba lanmas ylager ekle ir. Formalinin apraz ba larolu turmas yava bir s re tir. rik asit kristallerinin erimesine yol a ar. 26

FORMALN Elektron mikroskobik inceleme ncesi tespitte uygun de ildir. Beklemekle asidik karakter kazand ndan,pH n n ~7,0 olarak ayarlanmas i in tampon sistemleri kullan l r. r: kalsiyum karbonat, magnezyum karbonat, fosfat tamponlar .. Tampon i ermeyen formalinin raf mr k sad r. 27

FORMALN HAZIRLANII 1. % 10 luk formalin sol syonu : % 40 l k formalin 100 ml Distile su .900 ml 2. N tral tamponlanm formalin (NTF) : % 40 l k formalin .100 ml Distile su .....900 ml Sodyum di-hidrojen fosfat, monohidrat ..4 gr di-sodyum hidrojen fosfat anhidr z ..........6.5 gr 28

ALKOL Etil alkol (%70-100) nadiren primer fiksatif olarak kullan lmaktad r. Glikojenin korunmas ve baz histokimyasal al malar i in kullan labilir. Bir ok dezavantaja sahiptir. Dokudan su ekerek sertle mesine, b z lmesine, h cre distorsiyonu ve protein denat rasyonuna neden olur. Ya lar n erimesine yol a abilece inden lipid al malar nda ve myelin boyalar s z konusu oldu unda kullan lmamal d r. 29

CARNOY FKSATF Glacial asetik asit, absol etanol ve kloroformdan meydana gelir. Her t rl dokunun tespitinde kullan labilir. H zl penetrasyon g sterir. Glikojen ve plazma h creleri i in iyi bir fiksatiftir. N kleik asitlerin incelenmesini gerektiren durumlarda nerilmektedir. 30

CARNOY FKSATF B z lme ve sertle meyi nlemek i in tespit 4 saatten k sa tutulmal d r. Kloroform tehlike yaratabilir. Kollajen iyi korunmaz. Eritrositler lizise u rar. Asitte eriyebilen h cre gran lleri ve pigmentler kaybolabilir. 31

BOUN SOLSYONU Pikrik asit, formaldehit ve asetik asitten meydana gelir. zellikle k k biyopsiler i in ye lenir. Klasik olarak testis biyopsilerinin tespitinde nerilmektedir. K k lenf nodlar n nbulunmas nda i e yarayabilir. Ya dokusu sar ya boyan rken lenf nod lleri beyaz olarak izlenir. 32

BOUN SOLSYONU Doku k r lgan hale gelebilece inden 18 saatten k sa tespit yap lmal d r. B y k materyallerin tespit edilmemesi gerekir. Eritrositler lizise u rar ve demir ile k k kalsiyum depolanmalar z n rler. Pikrik asit DNA degredasyonuna yol a abilir. 33

Hollande solsyonu Pikrik asit, formalin, asetik asit, bak r asetattan meydana gelir. Bouin sol syonunun modifikasyonudur. Gastrointestinal trakt s ba ta olmak zere k k biyopsilerin tespitinde kullan l r. 34

B5 fiksatifi Civa klorur, sodyum asetat ve formalinden olu ur. Lenf nodlar , dalak gibi dokular ile lenfoproliferatif hastal kku kusu bulunan t m dokular n rutin tespitinde kullan l r. B5 stabil bir fiksatif olmad ndan taze olarak haz rlanmas gerekir. A r tespit, dokuda sertle me ve frajiliteye yol a t ndan B5 de 2-4 saat kald ktan sonra formaline al nmas gerekir. 35

Zenker fiksatifi Potasyum dikromat, civa klor r ve glacial asetik asitten olu ur. Kemik ili i biyopsileri i in kullan labilir. Dokular h zl bir ekilde 8-12 saat i inde tespit olur. Histolojik ayr nt ok iyidir. Eritrositler eridi indenkanl materyaller i in ye lenebilir. Fiksasyondan sonra kromat birikintilerini uzakla t rmak i in akarsuda y kanmas ve rutin boyamadan nce civay uzakla t rmak i in iyotla muamele gerekir. Molek ler analizler ve imm nohistokimya i in uygun de ildir. Cival fiksatiflerle birlikte metal enstr manlar kullan lmamal d r. 36