Pirognio e Endotoxina Bacteriana: Estudo Histórico e Atual

Pirognio e Endotoxina Bacteriana QUEST ES DE PROVAS; CONTE DO DAS PR XIMAS AULAS; HOR RIO DE ATENDIMENTO ON-LINE; blog do professor: http://chicoteixeira.wordpress.com

Histrico PIROG NIO E FEBRE Febre: mecanismo terap utico ou patofisiol gico

Histrico Inje es intravenosas de material p trido

Histrico VACINAS Salmonella typhi

Histrico Pelletier e Caventou XIX Com o isolamento do antipir tico quinina, estudos em animais permitiram conhecer os efeitos de pirexia e antit rmicos;

Histrico Por m, Billbroth foi o primeiro a usar o termo pyrogen, ou pirog nio, para descrever o princ pio promotor de febre. Ele foi capaz de produzir a febre em cachorros injetando gua destilada nestes animais; Panum O termo pyrogen e subst ncia pirog nica foi ent o usado por outros autores, entre os quais Burdon-Sanderson, que escreveram sobre o processo da febre originada de agente ex geno, como a bact ria, ou de origem end gena da c lula do hospedeiro;

Histrico Durante a ltima d cada do s culo XIX, Centanni conduziu estudos significativos quanto aos agentes respons veis pela febre; Entre outros, ele descreveu um procedimento para isolar a toxina bacteriana respons vel pela a o febril; Mantendo cultura de bact rias Gram (-) sob aut lise durante longos per odos, procedendo a sua filtra o esterilizante e ent o submetendo-as a fracionamento em lcool, ele obteve p branco altamente pirog nico, a partir de larga variedade de bact rias;

Histrico

Histrico Pseudomonas aeruginosa Salmonella sp.

Histrico Por m, a elimina o de bact rias por esteriliza o t rmica ou filtra o n o eliminava a pirogenicidade destas prepara es; Primeiro entendimento da febre das inje es 1912 em investiga es relatadas por Hort e Penfold;

Histrico Outros pesquisadores confirmaram as informa es e enfatizaram a import ncia de evitar contamina o microbiana em todos os farmac utica; est gios da produ o Versus Esterilidade Pirogenicidade

Histrico Estudo colaborativo Estabelecer um sistema animal que pudesse ser usado para avaliar a pirogenicidade de solu es; USP XII PRIMEIRO TESTE DE PIROG NIO OFICIAL, 1942

Histrico Em paralelo, continuavam os esfor os no sentido de purificar e caracterizar a endotoxina, tendo sido obtidos isolados pirog nicos por diferentes pesquisadores; Shear e Turner isolaram uma prepara o de endotoxina de Serratia marcescens que apresentava tanto toxicidade quanto pirogenicidade e foram os primeiros a aplicar o termo lipopolissacar deo ao extrato de endotoxina;

Histrico 1,0 ng/kg Respostas Febris

Histrico Foram necess rios 20 anos de trabalho desses autores, e outros pesquisadores, para demonstrar que a por o lip dica do LPS respons vel pelas rea es biol gicas induzidas pela endotoxina;

Pirognio endgeno Oakley et al., 2011

Pirognio endgeno interessante a presen a frequente da febre em doen as malignas, o que se pode explicar como uma libera o espont nea de PE por alguns tipos de c lulas tumorais;

Endotoxinas Constituem-se na mais significativa fonte de pirog nio para a ind stria farmac utica, quando n o purificadas podem conter lip deos, carboidratos e prote nas, mas quando purificadas s o denominadas lipopolissacarideos (LPS); Apresentam uma regi o hidrof lica polissacar dea ligada covalentemente a uma regi o hidrof bica, conhecida como lip deo A; A regi o polissacar dea altamente vari vel entre as esp cies de bact rias Gram (-), j o lip deo A uma estrutura bastante conservadora, sendo respons vel pela atividade biol gica;

Atividade Biolgica Muitas atividades biol gicas s o atribu das unidade lip deo A da endotoxina: pirogenicidade, toxicidade letal, leucopenia, seguida de leucocitose, necrose da medula ssea, reabsor o do osso embrion rio, ativa o do complemento, queda de press o sangu nea, agrega o plaquet ria, indu o de resist ncia n o espec fica infec o, atividade de macr fagos, indu o de s ntese de IgG, indu o produ o de interferon, indu o produ o de TNF, gelifica o do lisado do ameb cito de Limulus; O mecanismo de indu o da febre envolve a fagocitose do lip deo A, sendo produzido pirog nio end geno, que ent o atravessa a barreira hematoencef lica e age no hipot lamo;

Atividade Biolgica Diferentemente da maioria dos animais e humanos, os ratos e camundongos apresentam resposta hipot rmica ap s administra o parenteral de endotoxina; Usando o recurso de inje o direta nos ventr culos cerebrais, foi poss vel a promo o da febre, permitindo inferir que o centro termorregulador de ratos capaz de responder ao lip deo A; Demonstrando tamb m que o lip deo A, ou o pirog nio end geno, injetados intravenosamente n o atravessam a barreira hematoencef lica e a hipotermia decorre do efeito t xico do lip deo A sobre os vasos da pele;

Nveis Pirognicos A quest o de n veis pirog nicos torna-se crucial ao considerar os limites de libera o para os produtos farmac uticos; 1980 50 pg/mL (0,5 ng/Kg); Posteriormente 35 pg/mL; Sob evid ncia cient fica, 100 pg/mL um limite de libera o aceit vel para parenterais de grande volume e proporciona um significativo fator de seguran a sobre o teste de pirog nio em coelhos;

Nveis Pirognicos <<<<<<< 10 vezes Esta diferencia o n o implica desm rito no emprego do teste de pirog nio em coelhos, como preditivo do risco pirog nico para humanos;

Nveis Pirognicos Mostrou-se que os n veis-limite em ambas as esp cies ficam entre 0,1 e 0,14 ng/Kg para S. typhosa, 1,0 ng/Kg para E. coli, e de 50 a 70 ng/Kg para Pseudomonas sp; Vale ressaltar que os limites correspondem a prepara es purificadas, enquanto as endotoxinas que ocorrem na natureza como contaminantes de produtos farmac uticos apresentam comportamentos distintos; Assim, a pirogenicidade pode depender de qual a endotoxina estudada, assim como do n vel da dose; 0,1 ng/mL permite um consider vel fator de seguran a quanto pirogenicidade em humanos;

Processos de despirogenizao Inativa o Remo o Endotoxinas A inativa o pode ser obtida pela detoxifica o da mol cula de lipopolissacar deo LPS, usando tratamentos qu micos que quebrem partes l beis ou bloqueiem s tios necess rios atividade pirog nica, como alternativa pode ser usada alta temperatura;

Processos de despirogenizao Inativa o Remo o Endotoxinas A remo o de endotoxinas pode tamb m ocorrer por diferentes m todos, baseada em caracter sticas f sicas da endotoxina, como tamanho, peso molecular, carga eletrost tica, ou afinidade da endotoxina com diferentes superf cies;

Despirogenizao por Inativa o da Endotoxina Hidr lise cido-Base; Oxida o; Alquila o; Processo T rmico; Radia o Ionizante;

Despirogenizao por Remo o de Endotoxinas Lavagem; Destila o; Ultrafiltra o; Osmose Reversa; Carv o Ativo;

Obteno de Produtos Apirog nicos Ap s a observa o dos m todos despirogenizantes, por inativa o ou remo o, ficam evidentes as limita es quanto sua aplica o no produto terminado; Exceto nos m todos cl ssicos de obten o de gua apirog nica, assim como na aplica o de calor seco, em condi es dr sticas, a material termoest vel (material de acondicionamento, por exemplo), os demais m todos s o extremamente espec ficos, ou apenas se justificam em medicamentos ou produtos biol gicos de alt ssimo valor agregado;

Obteno de Produtos Apirog nicos Deve permanecer fortemente sedimentada a import ncia de trabalhar, durante todo o processo produtivo, em condi es adequadas de higiene, relativamente a operadores e ao ambiente, al m de empregar mat rias- primas com baixas cargas microbianas, processos validados, pessoal qualificado e treinado. Em suma aplicar todos os conceitos de Boas Pr ticas de Fabrica o, de forma que o produto seja obtido apirog nico no primeiro processamento, dispensando preocupa es quanto a reprocessos ou tratamentos adicionais;

Obteno de Produtos Apirog nicos Todas as monitora es de processo, assim como testes de mat rias-primas, com particular aten o s de origem natural, e do produto terminado, devem empregar t cnicas anal ticas validadas, seja com a metodologia cl ssica, empregando coelhos, ou diferentes m todos empregando a t cnica in vitro do LAL;

Determinao de Endotoxinas Lisado do ameb cito de Limulus (LAL); Desde 1885 observou-se que o sangue do L. polyphemus, o caranguejo em forma de ferradura de cavalo, formava um co gulo em gel s lido, quando removido do animal; V rios aspectos dessa coagula o foram estudados, com particular refer ncia aos ameb citos, a nica c lula circulante encontrada no sangue do Limulus; Em 1956, Bang verificou que bact rias Gram (-) eram capazes de fazer uma doen a fulminante em caranguejos;

Determinao de Endotoxinas Lisado do ameb cito de Limulus (LAL); Esta doen a era caracterizada por extensiva coagula o intravascular, e consequente morte; Em 1964, Levin e Bang apresentaram estudos sobre este mecanismo de rea o, demonstrando que os ameb citos eram necess rios para a rea o e que os agentes de coagula o est o somente nos ameb citos; Assim, descreveram o fen meno que mais tarde seria a base para o ensaio LAL;

Determinao de Endotoxinas